LmNotch基因在飛蝗翅發(fā)育中的功能分析

　　摘要：Notch 是 Notch 信號(hào)通路中的受體蛋白，與配體結(jié)合后調(diào)控下游靶標(biāo)基因的表達(dá)，在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的發(fā)育和分化過程中發(fā)揮著重要的作用。本文以飛蝗為研究對(duì)象，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索獲得 Notch 信號(hào)通路受體基因 LmNotch，并利用 qRT-PCR 對(duì) 5 齡飛蝗不同組織及不同發(fā)育時(shí)期翅芽組織中的 LmNotch 表達(dá)特性進(jìn)行了分析。通過 RNA 干擾試驗(yàn)對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)注射 dsLmNotch 的飛蝗有 70%無法完成蛻皮過程，10%的飛蝗在蛻皮后出現(xiàn)翅紊亂表型。飛蝗翅芽石蠟切片的 H&E 染色結(jié)果表明，處理組翅上下兩層表皮之間腔空間增大，新表皮無法完整形成。qRT-PCR 檢測(cè)其他翅發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)， LmNotch 表達(dá)量的下降影響翅發(fā)育相關(guān)基因 Dpp、Omb、Yorkie 以及翅特異表皮蛋白基因的表達(dá)。上述研究結(jié)果可為昆蟲翅發(fā)育機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為害蟲生物防治提供潛在靶標(biāo)。

　　徐子龍; 張福斌; 武兆辰; 張晶; 張建珍; 趙小明， 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) 發(fā)表時(shí)間：2021-09-16

　　關(guān) 鍵 詞：飛蝗;RNA 干擾;翅發(fā)育;Notch

　　昆蟲是世界上數(shù)量最多、種類最大的生物類群，也是唯一一種進(jìn)化出了飛行能力的無脊椎動(dòng)物。翅在昆蟲遷飛、求偶、覓食和躲避敵害等方面具有重要作用[1]。昆蟲的翅是由外胚層發(fā)育而來，完全變態(tài)昆蟲是由保留在幼蟲體內(nèi)的器官芽經(jīng)過完全變態(tài)發(fā)育成為完整的翅，如黑腹果蠅 Drosophila melanogaster 等;漸變態(tài)昆蟲則由若蟲的“翅芽”經(jīng)過不完全變態(tài)發(fā)育成為完整的翅，如飛蝗 Locusta migratoria 等[2]。因此，對(duì)昆蟲翅發(fā)育過程的研究將有助于了解昆蟲的變態(tài)。昆蟲翅發(fā)育的控制是一個(gè)非常精確和復(fù)雜的過程。目前，對(duì)昆蟲翅發(fā)育機(jī)制的研究主要來自黑腹果蠅[3]。在果蠅中，翅的發(fā)育受到 Decapentaplegic(Dpp)、Wingless (Wg)、Hedgehog(Hh)、Hippo、Notch 以及 JNK 等信號(hào)通路的調(diào)控[4-6]，而且在許多不同的動(dòng)物中，這些信號(hào)通路在進(jìn)化上是高度保守的。目前，在很多模式昆蟲中這些信號(hào)通路中的一些影響翅發(fā)育的關(guān)鍵基因已被鑒定出來，如黑腹果蠅和赤擬谷盜 Tribolium castaneum 等[7-10]。

　　Notch 信號(hào)通路在動(dòng)物中是高度保守的，在細(xì)胞發(fā)育過程中控制細(xì)胞命運(yùn)，并維持成體組織的穩(wěn)態(tài)[11,12]。Notch 信號(hào)通路主要由 Notch 受體、Notch 配體(Delta(Dl)，Serrate(Ser))、 CSL(C promoter binding factor-1 (CBF1), Suppressor of hairless (Su(H)), Lag-1)轉(zhuǎn)錄因子、其他效應(yīng)子與 Notch 調(diào)節(jié)分子構(gòu)成[13]。其激活依賴于一個(gè)細(xì)胞膜上的配體與相鄰細(xì)胞的 Notch 受體結(jié)合，這種結(jié)合使得 Notch 的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 NICD(intracellular domain of Notch)的釋放，之后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子 CSL 結(jié)合，調(diào)控其下游的基因表達(dá)[14,15]。Notch 是一個(gè) 300 kDa 的單次跨膜蛋白，由一個(gè)大的胞外區(qū)域、一個(gè)單一的跨膜部分和一個(gè)小的胞內(nèi)區(qū)域組成[16]，其中胞外結(jié)構(gòu)域由多個(gè)數(shù)量不同的 EGF(epidermal growth factor)重復(fù)單元、3 個(gè) Lin12/Notch repeats(LNRs)和一個(gè)鄰近跨膜結(jié)構(gòu)域組成，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括一個(gè) RAM(recombinationbinding protein-J–associated molecule)區(qū)域、7 個(gè)錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Ankyrin)、一個(gè)反激活區(qū)域(transactivation domain (TAD))和一個(gè) C 末端區(qū)域[11]。在昆蟲翅發(fā)育研究中，Notch 信號(hào)通路直接參與果蠅背部翅原基邊界的形成以及翅細(xì)胞的增殖分化[17]。然而，在非模式昆蟲中翅發(fā)育相關(guān)基因的鑒定及功能仍不清楚。

　　飛蝗是一種典型的漸變態(tài)昆蟲，也是世界性農(nóng)業(yè)害蟲。本文以 Notch 信號(hào)通路受體為研究對(duì)象，探討其在飛蝗翅發(fā)育中的功能，以期為漸變態(tài)昆蟲翅發(fā)育機(jī)制研究提供理論依據(jù)，同時(shí)為蝗蟲防治尋找新分子靶標(biāo)，從而為蝗災(zāi)生物防治提供基礎(chǔ)資料。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗(yàn)材料

　　試驗(yàn)所用飛蝗蟲卵保存于本實(shí)驗(yàn)室的昆蟲飼養(yǎng)室，于人工孵化箱中孵化后移至干凈的紗籠中，每天喂食新鮮的小麥幼苗(3 齡后輔以麥麩)，待其生長(zhǎng)至 5 齡后進(jìn)行試驗(yàn)。培養(yǎng)溫度為(30±2)℃，濕度為(40±10)%。

　　1.2 相關(guān)試劑

　　RNA 提取試劑(RNAiso Plus)購于大連寶生物公司(TaKaRa);雙鏈 RNA 合成試劑盒購于 Promega 公司;膠回收試劑盒購于天根公司(TIANGEN);HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

　　1.3 cDNA 序列獲取及聚類分析

　　基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫，搜索得到 LmNotch 基因的 cDNA 序列。將其 cDNA 序列翻譯成氨基酸序列，并對(duì)其編碼蛋白的功能域進(jìn)行分析。下載人 Homo sapiens、小鼠 Mus musculus、黑腹果蠅 D. melanogaster、亞洲玉米螟 Ostrinia furnacalis、棉鈴蟲 Helicoverpa armigera、赤擬谷盜 T. castaneum、德國(guó)小蠊 Blattella germanica 等物種的 Notch 氨基酸序列，利用 MEGA 6.0 軟件的 Neighbor-Joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，獨(dú)立分析 1000 次，數(shù)值代表 bootstrap 估算值。

　　1.4 總 RNA 的提取及表達(dá)特性分析

　　摘取 5 齡飛蝗第 1～8 d(N5D1-N5D8)的翅芽(WP)組織，同時(shí)取 5 齡第 6 d 的若蟲各個(gè)組織包括足(LG)、體壁(IN)、翅芽(WP)、脂肪體(FB)、前腸(FG)、中腸(MG)、后腸(HG)、胃盲囊(GC)、精巢(TE)、卵巢(OV)。利用 RNAiso Plus 提取總 RNA，最終定量至 0.5 μg/μL。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到 cDNA。通過 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì) LmNotch 基因的特異性熒光定量引物(表 1，由生工公司合成)，以 RPL-32 為內(nèi)參基因，利用 qRT-PCR 的方法檢測(cè) LmNotch 的時(shí)期和組織表達(dá)情況，設(shè)置 4 次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果用 2 -ΔΔCt 法進(jìn)行分析[18]。

　　1.5 RNA 干擾和 H&E 染色

　　根據(jù) LmNotch 的 cDNA 序列設(shè)計(jì)并合成帶有 T7 啟動(dòng)子序列的特異性引物(表 1，由生工公司合成)，以 5 齡若蟲翅芽 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度后利用膠回收試劑盒進(jìn)行膠純化。以 1 μg 膠回收產(chǎn)物為模板利用 dsRNA 合成試劑盒合成 LmNotch 基因的 dsRNA(dsLmNotch)，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)為單一條帶后定量至 2 μg/μL。選取 24 h 內(nèi)的 5 齡第 1 d 的飛蝗，對(duì)其注射 dsLmNotch(注射數(shù)量為 42 只)，每只的注射劑量為 10 μg，同時(shí)注射等量的 dsGFP(共 47 只)作為對(duì)照。取 5 齡第 6 d(N5D6)的飛蝗翅芽組織，一部分用于沉默效率檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)取 6 組重復(fù)，每組設(shè) 2 次技術(shù)重復(fù)，另一部分用 3%戊二醛進(jìn)行固定。同時(shí)摘取對(duì)照組和處理組蛻皮前(N5D7)的翅芽，用 3%戊二醛固定，隨后送往武漢塞維爾生物科技有限公司進(jìn)行石蠟切片和 H&E(伊紅和蘇木精)染色。剩余蟲子正常飼養(yǎng)進(jìn)行表型觀察。

　　1.6 LmNotch 對(duì)其他翅發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

　　利用課題組飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，識(shí)別翅發(fā)育相關(guān)基因包括 Dpp、Omb(optomotor-blind)、 Salm(spalt major)、Salr(spalt related)、Yorkie 以及翅特異表皮蛋白基因 LmACP7、LmACP8、 LmACP19。分別以 RNA 干擾的處理組和對(duì)照組個(gè)體翅芽組織 cDNA 為模板，利用 qRT-PCR 檢測(cè)其他翅發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，檢測(cè)引物見表 1(由生工公司合成)。

　　1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

　　采用 2 -ΔΔCt 法對(duì) LmNotch 基因在不同發(fā)育天數(shù)和不同組織中的相對(duì)表達(dá)量、RNA 干擾后 LmNotch 沉默效率、以及沉默 LmNotch 后翅發(fā)育相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，采用 Student t-test 方法進(jìn)行差異表達(dá)分析(*P<0.05表示差異顯著，** P<0.01表示差異極顯著)。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 LmNotch 功能域及聚類分析

　　根據(jù)飛蝗轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫，搜索獲得 LmNotch 基因 cDNA 序列，該基因含有 7455 bp 開放閱讀框，編碼 2484 個(gè)氨基酸。通過對(duì) LmNotch 基因編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其含有 36 個(gè) EGF(epidermal growth factor)重復(fù)單元、3 個(gè) NL(Lin-12/Notch)結(jié)構(gòu)域、1 個(gè)NOD(NOTCH protein domain)結(jié)構(gòu)域、1 個(gè) NODP 結(jié)構(gòu)域、7 個(gè) ANK(Ankyrin repeats)結(jié)構(gòu)域和 1 個(gè) DUF3454(Domain of unknown function)區(qū)域(圖 1A)。聚類分析顯示，Notch 在物種間保守性較高，且 LmNotch 與蜚蠊目 Notch 聚為一支(圖 1B)。

　　2.2 LmNotch 在 5 齡飛蝗中的表達(dá)特性

　　利用 qRT-PCR 進(jìn)行 LmNotch 的表達(dá)特性檢測(cè)，結(jié)果顯示 LmNotch 在 5 齡若蟲翅芽發(fā)育第 1～4 d 的表達(dá)量較高(N5D1～N5D4)，而在第 5～8 d 表達(dá)量較低(N5D5～N5D8)(圖 2A);LmNotch 在足、翅芽、前腸和卵巢中有較高表達(dá)，而在其他組織中表達(dá)量相對(duì)較低(圖 2B)。

　　2.3 LmNotch 生物學(xué)功能分析

　　對(duì) 5 齡第 2 d 的飛蝗注射 dsLmNotch，以注射等量 dsGFP 的飛蝗為對(duì)照，取翅芽檢測(cè)沉默效率。結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，處理組中 LmNotch 表達(dá)極顯著降低(圖 3A)。表型觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組飛蝗均能蛻皮至成蟲，而注射 dsLmNotch 的飛蝗約 70%無法完成蛻皮過程產(chǎn)生致死表型，另有 10%的飛蝗能夠蛻至成蟲但出現(xiàn)翅紊亂表型(圖 3B，3C)。分別對(duì) N5D6 和 N5D7 的對(duì)照組和處理組飛蝗翅芽進(jìn)行石蠟切片和 H&E 染色分析，結(jié)果顯示，對(duì)照組中 N5D6 和 N5D7 翅芽舊表皮發(fā)生降解，形成大量新表皮并產(chǎn)生折疊，上下兩層新表皮間形成空腔，而處理組中翅芽舊表皮雖能夠正常降解但翅上下兩層表皮之間腔空間增大，新表皮無法完整形成(圖 4)。

　　2.4 LmNotch 影響翅發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)

　　利用 qRT-PCR 檢測(cè)沉默 LmNotch 的表達(dá)后翅發(fā)育相關(guān)基因及翅特異表皮蛋白基因的表達(dá)，結(jié)果顯示 Dpp、Omb、LmACP7 和 LmACP8 基因的表達(dá)量顯著降低，而 Yorkie 和 LmACP19 的表達(dá)量顯著升高(圖 5)。

　　3 討論

　　本文基于飛蝗翅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得了 Notch 信號(hào)通路中關(guān)鍵受體因子 Notch。與其他物種 Notch 類似，飛蝗 Notch 含有 EGF 重復(fù)單元、Lin-12/Notch 結(jié)構(gòu)域、NOD/NODP 結(jié)構(gòu)域和 ANK 結(jié)構(gòu)域，且該蛋白在物種間高度保守(圖 1)，暗示其可能具有保守性功能。已有研究表明 Notch 在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成中的細(xì)胞分化增殖和凋亡具有重要作用 [19]。如果蠅中，Notch 的重復(fù)單元 EGF-23 到 EGF-29 發(fā)生單個(gè)氨基酸替換時(shí)，導(dǎo)致果蠅 Notch 信號(hào)的異常從而發(fā)生表型變化[20]。在哺乳動(dòng)物中，研究表明 Notch 信號(hào)通路對(duì)哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等發(fā)育具有重要作用[21]。

　　在無脊椎動(dòng)物中，昆蟲是唯一有翅的生物類群。昆蟲翅的發(fā)育受到一系列信號(hào)通路的控制，如 Hippo，Wingless，Dpp 和 Notch 等信號(hào)通路。在家蠶 Bombyx mori 中，干擾 Hippo 信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄共激活因子 BmYorkie3 的表達(dá)能夠抑制翅生長(zhǎng)發(fā)育[22]。Dpp 信號(hào)通路靶基因 Sal(Salm 和 Salr)是飛蝗和果蠅翅生長(zhǎng)發(fā)育所必需的[23]。在飛蝗中，LmNotch 在翅芽組織中高表達(dá)(圖 2)，可能參與飛蝗翅的發(fā)育。利用飛蝗對(duì) RNA 干擾的敏感性，合成并向 5 齡若蟲注射 LmNotch 基因 dsRNA，結(jié)果顯示 LmNotch 沉默效率達(dá)到 90%以上，且沉默 LmNotch 的飛蝗個(gè)體出現(xiàn)蛻皮困難和翅紊亂的表型(圖 3)，表明 LmNotch 在飛蝗蛻皮和翅發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，但 LmNotch 如何影響飛蝗蛻皮和翅發(fā)育尚不清楚。據(jù)報(bào)道，Notch 受體與配體 Delta (Dl)和/或 Serrate 結(jié)合后，會(huì)經(jīng)歷一系列的蛋白水解，從而產(chǎn)生 Notch 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain，NICD)[24]。NICD 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與轉(zhuǎn)錄因子 Hairless和協(xié)同激活因子 Mastermind 結(jié)合，刺激下游靶基因的表達(dá)[25]。為了探討 LmNotch 在飛蝗翅發(fā)育中的下游靶基因，作者根據(jù)果蠅翅發(fā)育相關(guān)基因序列(Dpp，Omb，Salm，Salr 和 Yorkie)搜索獲得了飛蝗同源基因序列并檢測(cè)了沉默 LmNotch 表達(dá)后翅發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默 LmNotch 表達(dá)后 Dpp 和 Omb 表達(dá)顯著下降，Yorkie 表達(dá)顯著上升，而 Salm 和 Salr 沒有顯著變化(圖 5)。2014 年，Djiane 等[26]研究發(fā)現(xiàn) Notch 能夠抑制果蠅翅原基中 Yorkie 的活性，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。同樣在果蠅翅發(fā)育研究中，Dpp 對(duì)其下游基因 omb 起正調(diào)節(jié)的作用[27]，而在飛蝗中沉默 LmNotch 表達(dá)后能夠降低 Dpp 和 Omb 的表達(dá)。上述結(jié)果表明，LmNotch 能夠調(diào)控 Hippo 和 Dpp 信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)而影響翅的發(fā)育。

　　昆蟲翅的發(fā)育除了受一系列復(fù)雜的基因控制外，還依賴于細(xì)胞的一系列功能和細(xì)胞外基質(zhì)。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)飛蝗翅特異表皮蛋白基因(LmACP7，LmACP8 和 LmACP19)在翅表皮細(xì)胞外基質(zhì)形成和穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用，這些基因的缺失可導(dǎo)致飛蝗翅發(fā)育異常[28-30]。本文研究發(fā)現(xiàn)，沉默 LmNotch 表達(dá)后能夠顯著抑制 LmACP7 和 LmACP8 的表達(dá)，而促進(jìn) LmACP19 的表達(dá)(圖 5)，這可能是導(dǎo)致翅表皮形成異常的原因之一(圖 4)，這些結(jié)果暗示 LmNotch 可能通過調(diào)控翅表皮蛋白基因的表達(dá)參與飛蝗翅表皮細(xì)胞外基質(zhì)的形成，然而其具體作用機(jī)制如何，還需要進(jìn)一步研究。