０引言

酯酶（Ｅｓｔｅｒａｓｅｓ，ＥＣ３．１．１．Ｘ）是一種催化酯鍵水解和合成的酶的總稱，水解時催化酯鍵產生甘油和脂肪酸；合成時，把酸的羧基與醇的羥基脫水縮合，產物為酯類及其他香味物質．它廣泛存在于動物、植物和微生物中．動物胰臟酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要來源．１８３４年Ｅｂｅｒｌｅ在兔胰臟中首次發現脂肪酶，微生物酯酶則以１９３５年Ｋｉｒｓｈ發現產脂肪酶的草酸青霉（ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍＯｘａｌｉｃｕｍ）為最早．由于微生物資源豐富，同時利用微生物發酵產酶具有便于工業化生產等優點，微生物酯酶得到關注，并且已經廣泛應用于農業、食品釀造、醫藥化學、污水處理和生物修復等領域，又由于酯酶的酶促反應具有較高的底物專一性、區域選擇性或者對映選擇性，它是合成手性化合物（如手性藥物，農藥等）的高效生物催化劑，微生物酯酶已成為研究熱點．

１微生物酯酶的組成及來源

１．１酯酶的組成

酯酶主要包括脂肪酶（Ｌｉｐａｓｅ，ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ＥＣ３．１．１．３）和羧酸酯酶（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅｓ，ａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ＥＣ３．１．１．１）［１－２］，兩者在生化方面沒有本質區別，只是在底物特異性上，羧酸酯酶傾向于水解酰基鏈長度小的底物（≤１０），而脂肪酶傾向于水解酰基鏈長度大的底物（≥１０）［３－４］，在結構上，酯酶屬于α／β水解酶超家族，具有Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ａｓｐ構成的催化中心三組合（ｃａｔａｌｙｔｉｃｔｒｉａｄ），其中Ｓｅｒ通常位于具有保守的Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｓｅｒ－Ｘａａ－Ｇｌｙ五肽結構內［１－２］．細菌脂肪酶又包括八大家族：ｔｒｕｅｌｉｐａｓｅ，ＧＤＳＬ，ＦａｍｉｌｙＩＩＩ，ｔｈｅｈｏｒｍｏｎｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｉｐａｓｅ（ＨＳＬ），ＦａｍｉｌｙＶ－ＶＩＩＩ，其中ｔｒｕｅｌｉｐａｓｅ又包括７個亞族ＳｕｂｆａｍｉｌｙＩ．１－Ｉ．７［２，５］．阿魏酸酯酶（Ｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄｅｓｔｅｒａｓｅ，ＥＣ．３．１．１．７３）又稱為肉桂酸酯酶，是最近分離出一種酯酶，它是羧酸酯水解酶的一個亞類，它能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵［６］．

１．２微生物酯酶的來源

在自然界中能產生酯酶的微生物資源是非常豐富的，從分類上看主要是真菌，真菌中主要是青霉、鏈孢霉、紅曲霉、黑曲霉、黃曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、犁頭霉、須霉、白地霉和核盤菌等１２屬２３種；其次是細菌，在細菌中主要是芽孢桿菌屬、假單胞菌屬以及伯克霍爾德菌屬等；另外，放線菌中的個別種類也能產生一定量的酯酶．２產酯酶微生物的篩選及酶活力的測定一般篩選流程為：樣品→富集培養→平板分離→平板初篩（觀察透明圈）→搖瓶復篩（測酶活力大小），三油酸甘油酯是產酯酶微生物初篩加入培養基中的常用底物，因為初篩選用平板培養基，而在培養基中存在不互溶的油、水兩相，所以要對它們先進行乳化，乳化劑可選用聚乙烯醇或者吐溫．溴甲酚紫由于反應后ｐＨ變化顯色，而ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ由于可以和分解后的物質結合形成顯色物質，它們被用作常用指示劑加入培養基內［７］．對于酯酶活力的測定，常見方法有以下幾種：酯酶活力比色法，即以對硝基苯酚為底物，分光光度計測定４００ｎｍ處吸光度值［７］；酯酶活力滴定法，以ＮａＯＨ滴定三醋酸甘油酯在酯酶作用下釋放的醋酸來測定；α－乙酸萘酯比色法，即先繪制α－萘酚標準曲線，然后在ｐＨ１０的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩沖液中，以α－乙酸萘酯為底物和粗酶液反應，在５９５ｎｍ處測其吸光度值［８］．

３微生物酯酶與基因克隆

隨著分子生物學和宏基因組學的發展，越來越多的研究人員從不同環境樣品中篩選產酯酶微生物，克隆酯酶基因，構建高產的基因工程菌為進行后續的工業化生產打下基礎．其中的環境樣品的主要來源是土壤以及海洋，特別是海洋環境樣品，因為海洋環境包括低溫、高溫、高靜水壓、強酸、強堿以及營養條件極為貧乏的各種極端環境，微生物要在這樣的環境中生存，生理結構、代謝方式等都會發生一系列改變，所以從海洋中篩選到的微生物可能具備某些特殊的代謝產物，另外低溫酯酶的研究也十分廣泛，近年來已純化或克隆表達了從南北極、深海、高山凍土中分離到的低溫微生物產生的低溫脂肪酶，如菌株ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉＩＦＯ３４５８（ＰＦＬ），Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＫＢ７００Ａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．Ｂ１１－１，Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．ＬＰＢ４的脂肪酶［９－１２］．鄭鴻飛等［１３］從青島前海和膠州灣海區樣品中分離到１株產酯酶活力和穩定性較高的菌株ＥＢ２１；邵鐵娟等［１４］從２０００多份渤海海區海泥樣品中分離出一株新型脂肪酶高產菌株ＢｏｈａｉＳｅａ－９１４５，經鑒定為適冷性海洋酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）；張金偉等［１５］從南極普里茲灣深海沉積物中篩選到一株產低溫脂肪酶的菌株７１９５；林學政等［１６］從南大洋普里茲灣的水樣中篩選到一株產低溫脂肪酶的深海嗜冷菌２５１０１；ＪｅｏｎＪＨ等［１７］從南韓江華島潮汐平原沉淀物宏基因文庫中分離到一種耐鹽的酯酶基因亞型；一個新的酯酶基因ｅｓｔＤＬ３０從沖積土宏基因組文庫中被篩出，它由１５２４個核苷酸組成，編碼的蛋白質又５０７個氨基酸組成，這個酯酶蛋白屬于ｆａｍｉｌｙＶＩＩ［１８］；一個超表達的阿魏酸酯酶基因ｅｓｔＦ２７從土壤宏基因組文庫中被篩出［１９］．

４微生物酯酶的應用

４．１在食品加工方面的應用

酯酶主要通過酯交換［２０］、水解［２１，２２］及合成化合物等方式應用于食品加工方面．固定化脂肪酶現在已用于芳香酯的合成，而低分子量芳香酯多呈天然水果味，它們廣泛應用于食品、飲料等食品工業，Ｍｅｌｏ等［２３］研究用Ｒｈｉｚｏｐｕｓｓｐ．脂肪酶合成香茅醇芳香酯優化條件；利用酯酶使乳制品增香［２４］，在釀酒和食用醋的生產中，利用酯酶提高乙酸乙酯、乳酸乙酯等酯類的含量，使口感有明顯提高；食用油脂精煉工藝中，借助微生物酯酶在一定條件下能催化脂肪酸與甘油之間的酯化反應，從而把油中的大量游離脂肪酸轉變成中性甘油酯，提高了食用油的價值；脂肪酶在面包專用粉中還有面團調理的功能，使面包質地柔軟，顏色更白；酯酶催化合成單甘脂［２５］是使用量最大的食品乳化劑；阿魏酸是天然抗氧化劑，也是近年來國際認知的防癌物質，廣泛應用于食品原料中，目前已使用阿魏酸酯酶與其他酶協同從各種農作物副產品中提取阿魏酸［２６］，并且阿魏酸作為合成天然香蘭素的前體，利用微生物方法產生香蘭素，具有毒性低、安全性高的特點，應用于食品中．